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Traumata, Infektionen und Wundheilungsstörungen der Cornea können Narben hinterlassen, die das Sehvermögen beeinträchtigen. Die Entwicklung eines in-vitro-3D-Cornea-Modells soll eine Untersuchung neuer Wirkstoffe ohne Tierversuche ermöglichen.

Traumata, Infektionen und Wundheilungsstörungen der Hornhaut (Cornea) können Narben in der optischen Achse hinterlassen, die das Sehvermögen erheblich beeinträchtigen und - im schlimmsten Fall - zur Erblindung führen. Wirksamere Therapien zur Behandlung von Hornhautwunden und insbesondere zur Behandlung von Wundheilungsstörungen wären ein großer Fortschritt in der Augenheilkunde.

Es existieren bereits zahlreiche Methoden zur Testung der Reaktion der Hornhaut auf Chemikalien, Arzneimittel, Kosmetika oder andere Konsumprodukte. Der derzeitige Standard zur Untersuchung auf Augentoxizität ist der Draize-Augentest, bei dem eine Substanz an einem Kaninchenauge getestet wird. Hierbei handelt es sich um eine standardisierte Methode, bei welcher verschiedene Konzentrationen einer Substanz auf das Auge des lebendigen Tiers appliziert werden und anschließend der Befund der Augen zu verschieden Zeitpunkten evaluiert wird. Die Versuchstiere werden nach Abschluss der Testung geopfert.

Die Arbeitsgruppe konnte bereits in Vorarbeiten eine Unterscheidung aller UN-GHS-Kategorien in ihrem 3D-Cornea-Modell erreichen [2].

Das 3D-Cornea-Modell besteht aus Epithel und Stroma (Abb. 1), den beiden Schichten, in denen sich die Narbenbildung der Hornhaut hauptsächlich abspielt.

Abb. 1: Aufbau des 3D-Cornea-Modells.

 

 

Für das Stroma werden primäre humane Keratozyten in Typ-1-Kollagen kultiviert. Dieses Hydrogel wird auf eine Dicke von 500 µm komprimiert, um darauf immortalisierte oder primäre humane Epithelzellen auszusäen. Nach einem Tag Wachstum submers im Medium wird die Kultur für 9 Tage als air-lift fortgesetzt. Währenddessen bildet sich ein mehrschichtiges, nicht-verhornendes Plattenepithel aus, das dem Stroma-Ersatz aus Kollagen-Hydrogel fest aufliegt. Ab Tag 12 kann das fertige Modell für das zu untersuchende Szenario verwendet werden, zum Beispiel zur Infektion mit Pathogenen oder zur Simulation eines Wundheilungsprozesses.

Die Besonderheit dieses Modells liegt in der hohen Ähnlichkeit zur natürlichen humanen Hornhaut: Die Oberfläche bildet ein mehrschichtiges nicht-verhornendes Plattenepithel, das histologisch der humanen Hornhaut sehr ähnlich ist und zudem Hornhaut-Epithel-spezifische Marker exprimiert. Die so generierten Cornea-Modelle können für weitere 20 Tage in Kultur gehalten werden.

Folgende Ziele konnten erreicht werden:

1. Ein standardisierter Verwundungs-Mechanismus des Cornea-Modells mittels Excimer-Laser wurde etabliert.
2. Als Readout für das Ausmaß der Verwundung bzw. der Heilungsvorgänge im 3D-Cornea-Modell wurden folgende Parameter etabliert:
   a. Die Optische Kohärenztomographie (OCT) ermöglicht eine nicht-destruktive Vermessung der Wunde im Verlauf der Heilung, sowohl als objektives quantitatives Maß für Geschwindigkeit sowie für die Vollständigkeit der Wundheilung
   b. Die OCT-Fläche des Modells ist ein objektives quantitatives Maß für die Kontraktion des Modells und somit für den Beginn der Narbenbildung
   c. Die immunhistochemische (Semi-)Quantifizierung der Expression von alpha-SMA und F-Aktin spiegeln die Narbenbildung wider
   d. Die H&E-Färbung stellt als destruktive Methode die Wundheilung dar und erlaubt durch eine qualitative Darstellung der Anordnung der Fibroblasten die Beurteilung der Narbenbildung.
3. 3. Das Modell wurde anhand von bekannten Substanzen zur Modulation der Wundheilung validiert (Gentamicin, Rho-Kinase-Inhibitoren, Statine)

Mit dem 3D-Hemi-Cornea-Modell ist die Testung des Effektes bisher nicht etablierter Substanzen bezüglich ihres Einflusses auf die Wundheilung tierversuchsfrei und kostengünstig möglich.

Publikation:
Lotz, C., Kiesewetter, L., Schmid, F. F., Hansmann, J., Walles, H. & Groeber-Becker, F. Replacing the Draize eye test: Impedance spectroscopy as a 3R method to discriminate between all GHS categories for eye irritation. Sci Rep 8, 15049, doi:10.1038/s41598-018-33118-2 (2018).