Der biologische und mechanische Effekt der selektiven proinflammatorischen Zytokininhibition bei der degenerativen Bandscheibenerkrankung
PD Dr. med. Gernot Lang & Prof. Dr. med. Norbert Südkamp Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie, Universitätsklinikum Freiburg, Deutschland,
04/2016 - 12/2019
Die fortschreitende Degeneration der Bandscheibe, welche mitunter durch eine Entzündungsreaktion initiiert wird, ist eine der Hauptursachen für Rückenschmerzen.
Rückenschmerzen (Low Back Pain (LBP)) sind weltweit die häufigste Ursache für Arbeitsunfähigkeit und haben eine enorme sozioökonomische Bedeutung. Mehr als 40% der LBP-Fälle sind der „Degenerativen Bandscheibenerkrankung“ (Degenerative Disc Disease (DDD)) zuzuschreiben, die durch einen beschleunigten Katabolismus der Extrazellulärmatrix (EZM) der Bandscheibe (IVD) charakterisiert ist. Dieser Abbau wird induziert und getriggert durch mechanische Belastung, Trauma, genetische Prädisposition sowie Entzündung, und kann zu immobilisierenden Schmerzen, dysfunktionaler spinaler Biomechanik und neurologischen Komplikationen führen.
Derzeitige Behandlungsmethoden umfassen neben konservativen Therapien auch Wirbelkörperfusionen oder die Implantation einer künstlichen Bandscheibenprothese. Neben unbefriedigenden Langzeitergebnissen und häufigen Komplikationen adressiert keines dieser Verfahren die zugrundeliegende Pathologie von bandscheibenbedingten Rückenschmerzen. Proinflammatorische Zytokine wie TNF-α und IL-1β spielen eine Hauptrolle beim Fortschreiten sowie der Chronifizierung der DDD, da sie durch Stimulation von EZM-abbauenden Enzymen den Katabolismus der Bandscheibe beschleunigen und zur Schmerzsensibilisierung beitragen. Entzündungshemmende Therapien mit krankheitsmodifizierenden Antirheumatika (DMARDs) könnten eine weniger invasive Alternative bei DDD bieten. Momentan werden DMARDs vor allem in der Behandlung chronisch-entzündlicher Erkrankungenwie der rheumatoiden Arthritis oder des Morbus Crohn eingesetzt. Neue Studien legen jedoch nahe, dass Zytokininhibitoren auch bei DDD ein großes therapeutisches Potenzial besitzen könnten.
Zielsetzung: Das Ziel dieser Studie war (1) die Entwicklung eines Entzündungsmodells zur Simulation der Frühphase der degenerativen Bandscheibenerkrankung sowie (2) die Evaluation der biologischen und mechanischen Wirkung spezifischer Zytokininhibitoren als potenzielle Therapiealternative. Die Experimente wurden in einem Organkultursystem unter degenerativer dynamischer Belastung und entzündungsfördernden Bedingungen durchgeführt.
3R-Prinzip: Reduce, Replace, Refine: Erst kürzlich hat unsere Arbeitsgruppe einen ex vivo Bandscheiben-Organ-Kultur-Bioreaktor implementiert. Dieses Modell ist in der Lage, bovine Bandscheiben bis zu vier Wochen unter (dynamischer oder statischer) mechanischer Belastung und bei proinflammatorischen Bedingungen zu kultivieren. Dieses Verfahren ist weitaus realistischer und relevanter für die Untersuchung der Pathogenese der DDD bzw. neuer anti-inflammatorischer Behandlungsstrategien als herkömmliche Zellkulturexperimente. Gleichzeitig reduziert es die Notwendigkeit von in vivo Experimenten. Alle Kälberschwänze werden von lokalen Schlachthäusern bezogen. Kein Kalb musste für dieses Projekt extra getötet werden. Die bovinen Bandscheiben sind tierische Abfallprodukte, die im Schlachtprozess nicht für den menschlichen Verzehr genutzt werden. Das in diesem Projekt entwickelte Modell ist ein hocheffizienter Ansatz, um das Wechselspiel zwischen Bandscheibendegeneration und Entzündung sowie die molekularen Mechanismen und die biomechanischen Eigenschaften innerhalb einer 3D-Umgebung zu analysieren. Mit jedem Experiment, welches im Rahmen dieser ex vivo Studien durchgeführt wird (wofür zwei Kälberschwänze benötigt werden), kann auf die Tötung von zwei fast ausgewachsenen Großtieren im Rahmen eines in vivo Experiments verzichtet werden.
Projektverlauf:
1. Teil - Entwicklung eines Entzündungsmodells zur Simulation der Frühphase der degenerativen Bandscheibenerkrankung Die Arbeitsgruppe im AO Forschungsinstitut Davos hat innerhalb der letzten Jahre einen ex vivo Bandscheiben-Organ-Kultur-Bioreaktor implementiert und die Kulturbedingungen optimiert (Junger et al. 2009, 2010, 2012). Im Rahmen des InflamoDisc-Projekts wurde zwischen 2016 und 2017 das etablierte bovine Bandscheiben-Organkultur-System erfolgreich weiterentwickelt, um die Frühphase der DDD realistisch und unter degenerativen und proinflammatorischen Bedingungen zu simulieren (Lang et al., 2018). Um eine beschleunigte Degeneration zu fördern, wurden die Bandscheiben unter limitierter Nährlösung kultiviert und unter hochfrequenter dynamischer Axialbelastung für 2 Stunden / Tag (0.32–0.5 MPa; 5 Hz) für 4 Tage belastet. Um einen Entzündungsprozess zu induzieren, wurden die degenerativen Bandscheiben zusätzlich unter proinflammatorischen Bedingungen mittels Injektion von 100 ng TNF-α / Bandscheibe für 4 Tage kultiviert.
Ein spezifischer Bioreaktor (Abb. 2-B) wurde verwendet, um sinusförmige dynamische Kompression auf die Bandscheiben (IVDs) zu applizieren. Die IVDs werden dafür in geschlossenen Kammern unter sterilen Bedingungen gehalten. Die Bioreaktor-Einheiten stehen im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 und 85% Luftfeuchtigkeit. Nach 4 Tagen wurde das IVD Gewebe für die biochemische Analyse reseziert. Die Zellviabilität sowie der DNA-, Glycosaminoglycan- und Collagengehalt wurden gemessen. Die Genexpression von relevanten anabolen und katabolen IVD EZM Faktoren wurde untersucht. Schließlich erfolgte eine Safranin O / Fast Green Färbung zur histologischen Analyse. Die Ergebnisse unserer Arbeit zeigten, dass wir durch den kombinierten Einsatz von TNF- α und degenerativen Kulturbedingungen ein kataboles und proinflammatorisches Milieu schaffen und reproduzieren konnten, welches der Frühphase der DDD entspricht. Typische Entzündungsmediatoren, welche in der DDD mitwirken wurden in unserem Modell ebenfalls verstärkt exprimiert. Die erfolgreiche Weiterentwicklung des Organkulturmodells wurde 2018 publiziert und diente als Plattform für alle folgenden Experimente des Projekts.
Abb. 2: A Schema zur Dissektion der Rinderschwänze für das IVD Organkultursystem. B IVD Bioreaktorsystem zur Applikation von dynamischer Hochfrequenzbelastung. C Schema zur Analyse der biologischen und mechanischen Eigenschaften der Bandscheiben. D Exemplarische Safranin O/Fast Green Färbungen von bovinem Bandscheibengewebe.
2. Teil - Evaluation der biologischen und mechanischen Wirkung spezifischer Zytokininhibitoren als potenzielle Therapiealternative bei DDD Zuerst wurde die protektive Wirkung des IL-1 Antagonisten Anakinra und des IL-6 Antagonisten Tocilizumab im Rahmen unseres degenerativen und proinflammatorischen Bandscheiben-Organkultursystems untersucht. Sowohl die IL-1- als auch die IL-6 Inhibition zeigten kaum Wirkung gegenüber dem katabolen Milieu, welches die Frühphase der DDD realistisch repräsentieren soll. Jedoch konnten wir mehrfach verifizieren, dass unser modifiziertes Modell zuverlässig und reproduzierbar die katabolen und inflammatorischen Bedingungen simulieren konnte. Nach intensiver Recherche folgte eine Untersuchung der anti-inflammatorischen und anti-degenerativen Effekte des TNF-α Inhibitors Etanercept und des Janus Kinase (JAK) Inhibitors Tofacitinib. In der Therapiegruppe wurden dafür die TNF-α-/JAK3-Inhibitoren in die Bandscheibe appliziert bzw. in das Medium gegeben. Intakte IVDs dienten als Positivkontrolle. IVDs ohne Therapie dienten als Negativkontrolle. IVD Maße wurden zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Belastung aufgezeichnet. Nach 4 Tagen wurde das IVD Gewebe für die biochemische Analyse reseziert. Die Zellviabilität, und der DNA-, Glycosaminoglycan- und Collagen-gehalt wurden gemessen. Die Genexpression von relevanten anabolen und katabolen IVD EZM Faktoren wurde untersucht. Schließlich erfolgte eine Safranin O / Fast Green Färbung zur histologischen Analyse. Unsere Arbeiten zeigten, dass die Inhibition von TNF-α und Janus Kinase (JAK) vielversprechend ist. Die Anwendung von Etanercept und Tofacitinib reduzierte die Expression proinflammatorischer und kataboler Mediatoren und neutralisierte das degenerative Milieu innerhalb des Organkulturmodells. Allerdings ist für den klinischen Einsatz wahrscheinlich eine Kombination von anabolen und anti-inflammatorischen Wirkstoffen notwendig. Die erfolgreichen Untersuchungen konnten wir 2020 publizieren (Li et al., 2020).
Publikationen:
Lang G, Liu Y, Geries J, Zhou Z, Kubosch D, Südkamp NP, Richards RG, Alini M, Grad S, Li Z. An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition. J Tissue Eng Regen Med 12 (4), e2051-e2061.
Pfannkuche JJ, Guo W, Cui S, Ma J, Lang G, Peroglio M, Richards RG, Alini M, Grad S, Li Z (2019) Intervertebral disc organ culture for the investigation of disc pathology and regeneration - benefits, limitations, and future directions of bioreactors. Connect Tissue Res:1-18. doi: 10.1080/03008207.2019.1665652.
Du J, Pfannkuche JJ, Lang, G, Haeckel, S, Creemers L, Alini M, Grad S, Li Z (2020). Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha (JOR Spine, 2020)
Li Z, Gehlen Y, Heizmann F, Grad S, Alini A, Richards RG, Kubosch D, Südkamp NP, Izadpanah K, Kubosch EJ, Lang G (2020). Preclinical ex-vivo testing of anti-inflammatory drugs in a bovine intervertebral degenerative disc model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, section Tissue Engineering and Regenerative Medicine.
Preise/Stipendien/Auszeichnungen/Titel:
2017 DWG Nachwuchspreis for M.D. candidate Yishan Liu - best abstract and oral presentation award from German Spine Congress 2017 for “An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition"
2017 DGOOC Student scholarship for M.D. candidate Yishan Liu for her doctoral thesis “An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition"
2017 Finalist of best poster award on ORS 2017: A proinflammatory and degenerative intervertebral disc organ culture model by combining TNF-α intradiscal injection and detrimental dynamic loading
2018 DGOOC Student scholarship for M.D. candidate Yannik Gehlen for his doctoral thesis "The effect of the selective JAK3- Inhibitor Tofacitinib in degenerative disc disease"
2018 Finalists of best paper award DKOU ORS Travel Award 2018: “Anti-inflammatory and regenerative drug therapy as biological treatment for degenerative disc disease”
2018 Kurt-Steim-Award from Albert Ludwigs University Freiburg for “An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition”
2018 Finalist of ON/Eurospine Award for „Validation of anti-inflammatory and anti-degenerative drug therapy using a bioreactor- guided intervertebral Disc organ culture model “, EuroSpine 2018, Barcelona, Spain
2019 Berta-Ottenstein-Fellowship 2019 for Advanced Clinician Scientists – Gernot Lang
2020 Habilitation Gernot Lang - „Staged Therapeutic Concepts in Degenerative Disc Disease Including Biological and Minimally Invasive Treatment Approaches“
Poster-Präsentationen:
“A proinflammatory and degenerative intervertebral disc organ culture model by combining TNF-α intradiscal injection and detrimental dynamic loading”, ORS 2017 Annual Meeting, San Diego, CA, USA, 19.-22.03.2017
“Anti-inflammatory and regenerative drug therapy for the treatment of degenerative disc disease: Validation in organ culture model”. 2017 ORS PSRS 4th International Spine Research Symposium (poster), Philadelphia, PA, USA
„Validation of anti-inflammatory and anti-degenerative drug therapy using a bioreactor-guided intervertebral Disc organ culture model“, EuroSpine 2018, Barcelona, Spain
Vorträge:
“Proinflammatory cytokines in DDD – our next target?”, Spine Research Group meeting, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, September 26, 2016
“Inflammation in DDD”, Spine Research meeting, Shriners Hospitals for Children, The Orthopaedic Research Laboratory, McGill University, Montreal, Canada, September 28, 2016
“Biological approaches for disc repair and regeneration”, 10th New York City Minimally Invasive Spine and Navigation Course: Case-Based and Hands-On, December 12/16/2016, New York
“A proinflammatory and degenerative intervertebral disc organ culture model to investigate novel anti-inflammatory treatment approaches for degenerative disc disease“, Global Spine Congress 2017, Milano, Italy
“An intervertebral disc organ culture model mimicking proinflammatory and degenerative disease condition”, TERMIS EU 2017, Davos, Switzerland
“Establishment of a proinflammatory and degenerative intervertebral disc ex vivo system to investigate anti-inflammatory therapies for degenerative disc disease”, DKOU 2017, Berlin, Germany
"Entwicklung eines inflammatorischen und degenerativen Bandscheiben-Organkulturmodells zur Simulation der Frühphase der degenerativen Bandscheibenerkrankung", 12. German Spine Congress (DWG) 2017, Stuttgart, Germany - DWG Nachwuchspreis for Yishan Liu
“Short- and mid-term effect of TNF-α intradiscal injection and detrimental dynamic loading in intervertebral disc organ culture”, 2017 AOSpine Masters Symposium, Bern, Switzerland
“An intervertebral disc organ culture model mimicking proinflammatory and degenerative disease condition, 2017 TERMIS-EU, Davos, Switzerland
“Establishment of a proinflammatory and degenerative intervertebral disc organ culture model”, 2017 Biospine, Berlin, Germany
“Anti-inflammatory and regenerative drug therapy as biological treatment for degenerative disc disease”, DKOU 2018, Berlin, Germany
„Validation of anti-inflammatory and regenerative drug therapy in a bioreactor-guided intervertebral disc organ culture model“, ISSLS Annual Meeting 2018 in Banff, Canada
"Validation of anti-inflammatory and regenerative drug therapy in an intervertebral disc organ culture model", ECM, 2018, Davos, Switzerland
"Pre-clinical testing of anti-inflammatory compounds in an intervertebral disc organ culture model", BioSpine, 2019 Rome, Italy
"Preclinical Testing of Anti-Inflammatory Compounds Using a Whole Intervertebral Disc Organ Culture Model", Global Spine Congress, 2019, Toronto, Canada
"In vitro Evaluation der protektiven Wirkung von Losartan in der Behandlung der degenerativen Bandscheibenerkrankung" , 14. Deutscher Wirbelsäulenkongress, 28. – 30. November 2019, München
Ausführende Institutionen
Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie, Universitätsklinikum Freiburg, Deutschland
Studium der Humanmedizin in Bochum 2007-2013, Promotion 2014. Postdoctoral Research Fellowship am AO Research Institute Davos, Schweiz 2014-2015. Assistenzarzt in der Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie des Universitätsklinikums Freiburg 2015-16. 2016-2017 Postdoctoral Spine Fellow am Weill Cornell Medical College, Department of Neurological Surgery, New York, USA. Habilitation 2020. Seit 2020 Advanced Clinician Scientist Fellow des Berta-Ottenstein-Programms der Medizinischen Fakultät Freiburg.
Prof. Dr. med. Norbert Südkamp
Studium der Elektrotechnik, Diplom-Ingenieur 1976. Studium der Humanmedizin an der medizinischen Hochschule Hannover 1975-1981. Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Nachrichtentechnik Abt. Fernmeldetechnik der TU Hannover 1976-1980. Promotion 1982. Habilitation 1990. Professor (C3) für Unfallchirurgie an der Charité, Berlin 1992-2001. Kommissarischer Ärztlicher Direktor der Abteilung Unfallchirurgie, Chirurgische Universitätsklinik der Universität Freiburg 2000-2001. Ärztlicher Direktor der Klinik für Traumatologie, Professor für Unfallchirurgie 2001-2005. 2005-2019 Geschäftsführender Ärztlicher Direktor Department Orthopädie und Traumatologie. Seit 2019 Dekan der Medizinischen Fakultät der Universität Freiburg.
Kooperationspartner
Prof. Dr. Mauro Alini
Studium der Chemie an der Universität Lausanne. Promotion 1988. Bereichsleiter Shriners Hospital, Montreal, Canada 1992-1995. Assistant Professor Orthopaedic Division, McGill University, Montreal, Canada 1995-2000. Seit 2000 Leiter des Musculoskeletal Regeneration Program AO Research Institute Davos, Schweiz. Seit 2009 stellvertr. Direktor des AO Forschungsinstituts. 2015 Preisträger des Marshall R. Urist Award der Orthopedic Research Society (USA).
PD Dr. Sibylle Grad
Pharmazie-Studium an der Eidgenössischen Technischen Hochschule (ETH) Zürich. Naturwissenschaftliches Doktorat im Bereich Zellbiologie an der ETH und am Universitätsspital Zürich 1999. Postdoc am Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA 1999-2000; Postdoc und Research Scientist am AO Forschungsinstitut Davos 2000-2009; Gastwissenschaftlerin Tokai University School of Medicine, Japan 2006; seit 2009 Bereichsleiterin für Bandscheiben- und Knorpel-Forschung am AO Forschungsinstitut Davos. Habilitation 2018.
Prof. Dr. Zhen Li
Bachelor-Studium der Biotechnologie am Chu Kechen Honors College, Zhejiang University, Hangzhou, China 2001-2005. Doktorat am Department of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou, China 2005-2010 und am AO Research Institute Davos, Schweiz 2006-2009. Lecturer Shandong University School of Medicine, Jinan, China 2010. Postdoc am AO Research Institute Davos, Schweiz 2011-2013. Seit 2013 Research Scientist am AO Research Institute. Seit 2017 Gastprofessur der Shenzhen Universität in China. Seit 2018 Senior Research Scientist am AO Research Institute. Seit 2020 Deputy Focus Area Leader Intervertebral Disc and Cartilage Biology am AO Research Institute.
PD Dr. med. David-Christopher Kubosch
Studium der Humanmedizin an der Georg-August-Universität Göttingen 1997-2003. Arzt im Praktikum an der Klinik für Orthopädie der Universitätsklinik Freiburg 2003-2005. Assistenzarzt des Departments Orthopädie und Traumatologie der Universitätsklinik Freiburg 2005-2015. Promotion 2009. Seit 2009 Facharzt für Orthopädie und Unfallchirurgie. Habilitation 2017. Seit 2018 Geschäftsführender Oberarzt und Sektionsleiter Wirbelsäulenchirurgie.
Team
Yishan Liu
Studium der Humanmedizin am Tongji Medical College of HUST (Huazhong University of Science and Technology), Wuhan, China 2010-2012. Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg seit 2012. Seit 2016 Doktorandin der Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie des Universitätsklinikums Freiburg.
Janna Geries
Bachelor of Science (Sport and Exercise Science) University of Bedforshire, UK / University of the Sunshine Coast, Queensland 2004-2007. Seit 2011 Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Seit 2016 Doktorandin der Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie des Universitätsklinikums Freiburg.
Fabian Heizmann
Studium der Humanmedizin an der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel seit 2013. Seit 2016 Doktorand der Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie des Universitätsklinikums Freiburg.
Yannik Gehlen
2013-2020 Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Seit 2017 Doktorand der Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie des Universitätsklinikums Freiburg.
Judith Pfannkuche
Studium der Humanmedizin von 2012-2018 an der Riga-Stradiņš-University in Lettland. Seit 2018 Doktorandin der Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie des Universitätsklinikums Freiburg.