P-066

Embryonen des Zebrabärblings (Danio rerio) als Teil einer integrativen Teststrategie zur Prüfung auf Nephrotoxizität

Prof. Dr. Angela Mally & Dr. Daniel Liedtke,
Universität Würzburg,

06/2018-05/2020 

Embryonen des Zebrabärblings können helfen, Einschränkungen von in vitro Toxizitätstests zu überwinden und damit die Lücke zwischen Zell-basierten Hochdurchsatz Screening Assays und Toxizitätsprüfungen am Tier zu schließen.

Die Niere ist eines der wichtigsten Zielorgane für toxische Wirkungen von Fremdstoffen. Zahlreiche strukturell unterschiedliche Arzneistoffe, Naturstoffe und Chemikalien können an der Niere zu toxischen Schädigungen führen. Bislang werden nephrotoxische Wirkungen von Arzneimitteln und Chemikalien vor allem im Rahmen gesetzlich vorgeschriebener Toxizitätsprüfungen am Tier erfasst. Mit dem Ziel einer effizienteren Prüfung auf Toxizität und Vermeidung von Tierversuchen vollzieht sich derzeit jedoch ein Paradigmenwechsel in der toxikologischen Prüfung und Risikobewertung weg von apikalen Endpunkten für Toxizität im Tier hin zu In-vitro-Hochdurchsatzverfahren in alternativen Testsystemen. Während sich zellbasierte In-vitro-Assays vor allem durch ihre Hochdurchsatzfähigkeit auszeichnen, können sie die komplexen Vorgänge im Organismus nur unzureichend widerspiegeln und erlauben daher alleine keine hinreichend verlässlichen Aussagen über mögliche Gesundheitsrisiken von Arzneimitteln und Chemikalien. Embryonen des Zebrabärblings (Danio rerio), die nach den Regelungen des Tierschutzgesetzes bis zum fünften Tag nach der Befruchtung nicht als Tierversuch, sondern als in vitro Tests eingestuft werden, eignen sich in besonderer Weise als Alternativmodell für Toxizitätsscreening, da sie zum einen leicht zugänglich, kostengünstig und für den Einsatz im Hochdurchsatzverfahren geeignet sind, zum anderen die physiologischen Gegebenheiten im Gesamttier, insbesondere hinsichtlich Kinetik und Biotransformation, besser widerspiegeln als zellbasierte Assays.

Abb. 1: Drei Tage alter Embryo der transgenen wt1b:GFP Zebrafischlinie als Hellfeld- und Fluoreszenzaufnahme.
Der GFP-getagte Transkriptionsfaktor wt1b (Wilm´s tumor gene) markiert die Pronephros des Zebrafischembryos. Die Markierung erlaubt eine Isolierung und nachfolgende Untersuchung der Nierenzellen hinsichtlich Expression von Transportern und Fremdstoff-metabolisierenden Enzymen sowie molekularen Veränderungen nach Susbstanzexposition.

 

 

Trotz der relativ einfachen anatomischen Struktur des Pronephros im embryonalen Zebrafisch, bestehend aus lediglich zwei Nephronen, entsprechen der anatomische Aufbau (Glomerulus, proximaler Tubulus, distaler Tubulus, Sammelrohr) und die Funktion weitgehend der menschlichen Niere (Metanephros). Auch Zelltypen, Differenzierungswege und molekulare Signalwege sind zwischen der Niere des Zebrabärblings und der des Menschen bzw. höherer Vertebraten konserviert. Wichtige Stofftransporter (z.B. slc20a1a, sglt, slc13a3, slc4a4) sowie der endozytotische Rezeptor Megalin werden in entsprechenden Abschnitten des Pronephros exprimiert. Die glomeruläre Filtration setzt innerhalb von 48h nach Fertilisation ein. Damit erfüllen Zebrafischembryonen grundsätzlich entscheidende Anforderungen an ein alternatives Modell zur Prüfung auf Nephrotoxizität. Erste Vorarbeiten belegen die schädigende Wirkung ausgewählter Modellverbindungen auf das Pronephros embryonaler Zebrabärblinge. Während diese vorläufigen Daten auf ein immenses Potential des Modells als Screening-Methode zur frühen Identifizierung von Substanzen mit nephrotoxischem Potential hindeuten, müssen noch wesentliche Datenlücken geschlossen werden um zu belegen, dass Tests an embryonalen Zebrabärblingen als anzuerkennende Alternativmethode geeignet sind, relevante Daten für die toxikologische Bewertung von Substanzen zu liefern und die Lücke zwischen Zell-basierten Hochdurchsatz Screening Assays und Toxizitätsprüfungen am Tier zu schließen. Die im Projekt geplanten Arbeiten sollen Antworten auf die folgenden Fragen liefern:

  • Bestehen zwischen der Niere höherer Vertebraten und der des Zebrabärblings, insbesondere im embryonalen Stadium, wesentliche Unterschiede hinsichtlich der Expression von Fremdstoff-metabolisierenden Enzymen und Transportern, die im Menschen/Nager für die Organ-spezifische Wirkung von Fremdstoffen auf die Niere von Bedeutung sind?
  • Können Organ-spezifische Wirkungen von Fremdstoffen auf die Niere im adulten und embryonalen Zebrafisch-Modell hinsichtlich Art, Lokalisation und molekularen Veränderungen adäquat abgebildet werden?
  • Welche molekularen Marker eignen sich als empfindliche Endpukte für Nephrotoxizität im Zebrafischmodell?
  • Ist das Modell des embryonalen Zebrabärblings geeignet, neben der Identifizierung des nephrotoxischen Potenzials einer Verbindung auch relevante Daten für eine quantitative Risikobewertung zu liefen?

Ausführende Institution

Arbeitsgruppe Prof. Dr. Angela Mally:
Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Universität Würzburg
Versbacher Straße 9, 97078 Würzburg

Dr. Daniel Liedtke:
Institut für Humangenetik
Biozentrum
Universität Würzburg
97074 Würzburg

Förderlaufzeit

06/2018 - 05/2020

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