P-061

Hypothermische und neuroprotektive Therapie zur Validierung eines Degenerationsmodells der kultivierten Schweineretina

PD Dr. Stephanie Joachim
Universitäts-Augenklinik Bochum

Dr. Sven Schnichels
Universitäts-Augenklinik Tübingen

01/2017-12/2018

Organotypische Kulturen der Schweineretina bieten eine wichtige Alternative zum Tierversuch um die Pathomechanismen retinaler Degeneration zu analysieren und neue Therapieansätze zu testen.

Das Phänomen der Retinadegeneration betrifft zahlreiche Augenerkrankungen, wie das Glaukom oder die retinale Ischämie. Die Entstehungsprozesse dieser Erkrankungen sind bisher nicht vollständig verstanden, sodass Modelle benötigt werden, die dazu beitragen die pathologischen Veränderungen zu erfassen. Auch sind Modellsysteme zur Entwicklung neuer Therapieansätze und zur Testung neu entwickelter Therapiesubstanzen notwendig. Bisher basieren diese Studien meist auf akuten krankheitsinduzierten Tiermodellen, die eigens für die Versuche gezüchtet und getötet werden müssen. Organkulturen aus Explantaten der Schweineretina, die von Schlachttieren aus der Lebensmittelindustrie gewonnen werden können, bieten hier eine gute Alternative. Im Rahmen eines bereits von der Stiftung set geförderten Projektes konnten mehrere Degenerationsmodelle für das organotypische Kulturmodell der Schweineretina erfolgreich etabliert werden.

Im Rahmen dieses Projektes soll nun untersucht werden, ob mit Hilfe des Kobaltchlorid- (CoCl2) und des Wasserstoffperoxid-Degenerationsmodells (H2O2) nicht nur die zugrundeliegenden Prozesse der Retinadegeneration analysiert werden können (Kuehn et al. 2017; Hurst et al. 2017), sondern ob sich diese Modelle auch für das Screening von Therapeutika sowie der Testung von therapeutischen Behandlungen eignen, wie beispielsweise der Hypothermie. Dazu soll im Einzelnen untersucht werden, ob die Behandlung mit diversen therapeutischen Ansätzen, wie Hypothermie oder Inhibitoren, eine Protektion der retinalen Ganglienzellen hervorgerufen werden kann. Gerade diese erfolgreiche Therapietestung ist für die Anerkennung als Tierersatzversuch von eminenter Bedeutung.

Für das Projekt werden erneut Schweineretinae verwendet, die vom lokalen Schlachthof bezogen werden. Es werden somit keine Tiere extra und ausschließlich für diese Versuche getötet, sondern Abfallprodukte der Lebensmittelindustrie eingesetzt. Durch diese Studie sollen Versuchstiere in der ersten Testungsphase des Therapie-Screenings komplett ersetzt werden, so dass es sich hier um den Ersatz eines Tierversuchs handelt (Replace).
Die Größe der Schweineaugen bietet des Weiteren den entscheidenden Vorteil, dass aus einem Schweineauge vier vergleichbare Proben entnommen und dadurch die Resultate verschiedener Methoden statistisch exakter korreliert werden können. Im Vergleich dazu reicht bei Mäusen und Ratten die Augengröße lediglich für je eine Probe aus. Die Anzahl der benötigten Tiere könnte damit gegenüber den Mäuse- und Rattenaugen deutlich reduziert werden (Reduce).

Abbildung 1: Schweineretinaorgankultur und zeitlicher Ablauf der drei Degenerationsmodelle:
A) Die Präparation der Schweineretinaorgankultur erfolgt über das Öffnen des Auges, die Herstellung einer Kleeblattstruktur, dem Ausstanzen der Retina und Überführen derselben auf einen Filter. Anschließend kann die Retina im Neurobasal-A-Medium kultiviert und mit toxischen und protektiven Substanzen behandelt werden. B) Ablauf des H2O2-Degenerationsmodells. Die Behandlung mit H2O2 erfolgte an Tag 1 für drei Stunden. Nach drei und acht Tagen wurden die Proben histologisch sowie mittels PCR- und Western-Blot-Analysen untersucht. C) Ablauf des CoCl2-Degenerationsmodells. Die Behandlung mit CoCl2 erfolgte an Tag 1 für 48 Stunden. Nach vier und acht Tagen wurden die Proben histologisch sowie mittels PCR- und Western-Blot-Analysen untersucht.

 

 

Abbildung 2: Aktivierung verschiedenster Zelltodmechanismen in der Kobaltchlorid-behandelten Schweineretinaorgankultur:
A) Das Bax/Bcl-2-Verhältnis wurde auf mRNA-Ebene nach vier Tagen untersucht. Nur die 100- und 300-µM-CoCl2-Gruppe wies eine Erhöhung von Bax/Bcl-2 auf (beide: p<0,05). In der 500-µM-Gruppe war das Verhältnis sogar herunterreguliert (p<0,01). B) Nach acht Tagen konnte kein Unterschied zwischen den Gruppen gemessen werden. C) Der Ganglienzellmarker Brn-3a (grün) wurde immunhistologisch in Kombination mit der aktiven Caspase 3 (rot) und einem Zellkernmarker (DAPI, blau) angefärbt. D) Nach vier Tagen waren mehr Ganglienzellen in der 300-µM- (p<0,05) und 500-µM-CoCl2-Gruppe (p<0,01) apoptotisch. E) Der Anteil an apoptotischen retinalen Ganglienzellen erhöhte sich noch in beiden Gruppen nach acht Tagen (300 µM: p<0,001; 500 µM: p<0,01). Maßstab=20 µM, Abkürzungen: GCL=Ganglienzellschicht, IPL=innere plexiforme Schicht (Kuehn et al. 2017).

 

 

Ausführende Institution

Forschungslabor, Universitäts-Augenklinik, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr-Universität Bochum
In der Schornau 23-25, 44892 Bochum

Forschungslabor, Universitäts-Augenklinik Tübingen
Elfriede-Aulhorn-Str. 7, 72076 Tübingen

Förderlaufzeit

01/2017 - 12/2018

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